Bakanlık Adı Bakanlık Adı : Sağlık Bakanlığından: Tebliğin Adı : Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Tebliğ (Tebliğ No:İEG-2005/4) Tebliğ No : İEG-2005/4 R. Gazete Tarihi : 01/07/2005 R. Gazete Sayısı : 25862 KOZMETİK ÜRÜN BİLEŞİMLERİNİN KONTROLÜ İÇİN GEREKLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ HAKKINDA TEBLİĞ TEBLİĞ NO:İEG-2005/4 Amaç Madde 1- Bu Tebliğin amacı, gliserol 1-(4-aminobenzoat) tanı ve tayini, klorobutanol tayini, kinin tanı ve tayini, inorganik sülfitler’in ve hidrojen sülfitler’in tanı ve tayini, alkali metaller’in ve kloratlar’ın tanı ve tayini, sodyum iyodat tanı ve tayini konularındaki analiz yöntemleri ile ilgili usul ve esasları belirlemektir. Kapsam Madde 2- Bu Tebliğ, aşağıdaki analiz metodlarının uygulamalarını kapsar: a) Gliserol 1-(4-aminobenzoat) tanı ve tayini EK’teki Yöntem I’e göre yapılır. b) Klorobutanol tayini EK’teki Yöntem II’ye göre yapılır. c) Kinin tanı ve tayini EK’teki Yöntem III’e göre yapılır. d) İnorganik Sülfitler’in ve Hidrojen Sülfitler’in tanı ve tayini EK’teki Yöntem IV’e göre yapılır. e) Alkali Metaller’in ve Kloratlar’ın tanı ve tayini EK’teki Yöntem V’e göre yapılır. f) Sodyum İyodat tanı ve tayini EK’teki Yöntem VI’ya göre yapılır. Hukuki Dayanak Madde 3 - Bu Tebliğ, 23/5/2005 tarihli ve 25823 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanan Kozmetik Yönetmeliği’nin 16 ncı maddesine dayanılarak hazırlanmıştır. Uyumlaştırılan Avrupa Birliği Mevzuatı Madde 4- Bu Tebliğ, 85/490/EEC sayılı Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Dördüncü Komisyon Direktifi dikkate alınarak Avrupa Birliği mevzuatına uyum kapsamında hazırlanmıştır. Bu Tebliğ, laboratuarların denenmiş ve bilimsel geçerliliği olan yöntemleri kullanmasını engellemez. Yürürlük Madde 5- Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer. Yürütme Madde 6- Bu Tebliğ hükümlerini Sağlık Bakanı yürütür. EK YÖNTEM I- GLISEROL 1-(4-AMINOBENZOAT) TANI VE TAYİNİ A. TANI 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metodla alfa-monogliseril 4-aminobenzoat [gliserol 1-(4-aminobenzoat)]’ın saptaması yapılır. Bunun yanında safsızlık olarak bulunabilecek etil 4-aminobenzoat (benzokain INN)’ında saptaması yapılır. 2. PRENSİP Tanı işlemi ince tabaka metoduyla silikagel plakta (floresans indikatörlü) uygulanır ve plak üzerinde diazo boyası oluşumu kontrolüyle serbest primer amin grupları araştırılır. 3. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. 3.1. Çözücü karışımı: Siklohekzan / propan-2-ol / stabilize diklorometan (48 / 64 / 9, v/v/v) 3.2. Yürütme solvanı: Petrol eteri (40-60) / benzen / aseton / amonyum hidroksid solüsyonu (minimum % 25 NH3) (35 / 35 / 35 / 1, v/v/v/v) 3.3. Püskürtme solvanı: (a) Sodyum nitrit: 100 ml 1M hidroklorik asit içinde 1 gr (kullanılmadan hemen önce hazırlanır) (b) 2-naftol: 100 ml 1M potasyum hidroksit içinde 0.2 gr 3.4. Standart çözeltiler: - Alfa-monogliseril 4-aminobenzoat: 100 ml çözücü karışımı (3.1) içinde 0.05 gr - Etil 4-aminobenzoat: 100 ml çözücü karışımı (3.1) içinde 0.05 gr 3.5. Silikajel 60 F254 plaklar, 0.25 mm kalınlık, 200 mm x 200 mm 4. EKİPMAN 4.1. İnce tabaka kromatografisi için düzenekler 4.2. Ultrasonik banyo 4.3. Milipor filtre FH 0.5 µm veya eşdeğeri 5. İŞLEM 5.1. Örneğin Hazırlanması Analizi yapılacak 1.5 gr örnek 10 ml ölçülü balon içine tartılır. Hacme kadar çözücü (3.1) ile tamamlanır. Ağzı kapatılarak bir saat süreyle oda sıcaklığında ultrasonik karıştırıcı (4.2) içinde bekletilir. Milipor filtre (4.3) ile süzülür ve süzülen kısım daha sonra kromatografi için kullanılır. 5.2. İnce Tabaka Kromatografisi 10 µl örnek çözeltisi (5.1) ve her bir standart çözelti (3.4) plak (3.5) üzerine damlatılır. Daha önce yürütme solvanı (3.2) ile doyurulmuş tank içinde 150 mm yüksekliğe kadar plak yürütülür. Tanktan çıkartılan plak oda sıcaklığında kurumaya bırakılır. 5.3. Belirleme 5.3.1. Plak, 254 nm’de UV ışığı altında gözlenir. 5.3.2. Çözelti 3.3 (a) tamamen kurutulmuş plağa püskürtülür. Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle kurumasına izin verilir ve hemen çözelti 3.3 (b) püskürtülür. Plak etüvde 60oC sıcaklıkta kurutulur. Turuncu renkli lekeler görülür. Alfa-monogliseril 4-aminobenzoat: Rf 0.07; etil 4-aminobenzoat: Rf 0.55. B. TAYİN 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metodla alfa monogliseril 4-aminobenzoat tayini yapılır. Ayrıca etil 4-aminobenzoat tayininde de uygulanır. Yalnız bu metod % 5 (m/m)’den fazla alfa monogliseril 4-aminobenzoat ve % 1 (m/m)’den fazla etil 4-aminobenzoat ihtiva eden örneklere uygulanamaz. 2. TANIM Bu metodla örnekte tanımlanan alfa monogliseril 4-aminobenzoat ve etil 4-aminobenzoat miktarı % kütle cinsinden(% m/m) belirtilir. 3. PRENSİP Analiz edilecek örnek metonal içinde süspanse edilir ve uygun işlemlerden geçirildikten sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile (HPLC) tayin edilir. 4. REAKTİFLER Tüm çözeltiler analitik saflıkta olmalı ve gerekenler HPLC için uygun olmalıdır. 4.1. Metanol 4.2. Potasyum dihidrojenortofosfat (KH2PO4) 4.3. Çinko di (asetat) (Zn(CH3COO)2.2H2O) 4.4. Asetik asit (d420= 1.05) 4.5. Tetrapotasyum hekzasiyanoferrat, (K4(Fe(CN)6.3H2O) 4.6. Etil 4-hidroksibenzoat 4.7. Alfa monogliseril 4-aminobenzoat 4.8. Etil 4-aminobenzoat 4.9. Fosfat tampon çözeltisi (0.02M): 1 litre su içinde 2.72 g potasyum dihidrojenortofosfat (4.2) çözülür. 4.10. Yürütme solvanı: Fosfat tampon çözeltisi (4.9) / metan-ol (4.1) 61 / 39 (v/v). Rezolüsyon faktörü R ³ 1,5 elde etmek için mobil faz oranları değiştirilebilir. R= 2 d’R2 - d’R1 W1 + W2 Burada: R1 ve R2 = Piklerin alıkonma zamanları, dakika olarak. W1 ve W2 = Piklerin yarı yükseklikteki genişlikleri, mm olarak. d’ = Grafik hızı dakikada milimetre olarak. 4.11. Alfa-monogliseril 4-aminobenzoat stok çözeltisi: Yaklaşık 40 mg tam tartılmış alfa-monogliseril 4-amino benzoat 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır. 40 ml metanol (4.1) içinde çözülür. Tampon çözeltisi (4.9) ile hacme tamamlanır, karıştırılır. 4.12. Etil 4-aminobenzoat stok çözeltisi: Yaklaşık 40 mg tam tartılmış etil 4-aminobenzoat 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır. 40 ml metanol (4.1) içinde çözülür.Tampon çözelti (4.9) ile hacme tamamlanır, karıştırılır. 4.13. İnternal standart solüsyonu: Tam tartılmış yaklaşık 50 mg etil 4-hidrokoibenzoat (4.6) 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır. 40 ml metanol (4.1) içinde çözülür. Tampon çözelti ile (4.9) hacme tamamlanır. 4.14. Standart çözeltiler: Aşağıdaki tabloya göre, 100 ml yürütme solvanı (4.10) içinde çözülerek dört standart çözelti hazırlanır. Standart çözelti Alfa monogliseril 4-aminobenzoat Etil 4-aminobenzoat Etil 4-hidroksibenzoat (µg/ml) (*) ml(4.11) (µg/ml) (*) ml(4.12) (µg/ml) (*) ml(4.13) I 8 2 8 2 50 10 II 16 4 12 3 50 10 III 24 6 16 4 50 10 IV 40 10 20 5 50 10 (*) Bu değerler gösterge olarak verilmiş olup, 4.11, 4.12, 4.13’ün gerçek kütlelerine karşılık gelmektedir. NOT: Bu çözeltiler farklı bir yol izlenerek de hazırlanabilir. 4.15. Karez I çözeltisi: 26.5 gr tetrapotasyum hekzasiyanoferrat (4.5) bir miktar suda çözülür ve su ile 250 ml’ye tamamlanır. 4.16. Karez II çözeltisi: 54.9 gr çinko di (asetat) (4.3), 7.5 ml asetik asit (4.4) suda çözülür ve su ile 250 ml’ye tamamlanır. 4.17. Merck Lichrosorb RP-18 veya eşdeğeri, 5 µm partikül boyutlu. 5. EKİPMAN 5.1. Genel laboratuvar düzenekleri 5.2. Değişken dalga boyu olan UV dedektörlü ve 45oC’ye ayarlanmış kolon fırınlı yüksek performanslı sıvı kromatografi cihazı 5.3. Paslanmaz çelik kolon: Uzunluk : 250 mm İç çap : 4.6 mm Dolgu materyali : Lichrosorb RP-18 (4.17) 5.4. Ultrasonik banyo 6. İŞLEM 6.1. Örnek hazırlanması 6.1.1. 100 ml.lik beher içerisine yaklaşık olarak 1 gr örnek tam tartılır ve 10 ml metanol (4.1) ilave edilir. 6.1.2. Süspansiyon oluşması için bu beher 20 dakika süreyle ultrasonik banyoya (5.4) konulur. Bu şekilde elde edilen süspansiyon, 75 ml’den fazla yürütme solvanı (4.10) kullanmamak kaydıyla, 100 ml.lik bir ölçülü balona kantitatif olarak aktarılır. Sırasıyla 1 ml Karez I çözeltisi (4.15) ve 1 ml Karez II çözeltisi (4.16) ilave edilir ve her bir ilaveden sonra karıştırılır. Yürütme solvanı (4.10) ile hacme tamamlanır, tekrar karıştırılır ve filtre kağıdından süzülür. 6.1.3. 6.1.2’de elde edilen süzüntüden 3 ml ve 5 ml iç standart çözelti (4.13) 50 ml.lik ölçülü balona aktarılır. Hacme kadar yürütme solvanı (4.10) ile tamamlanır ve karıştırılır. Bu solüsyon kromatografi analizinde (6.2) kullanılır. 6.2. Kromatografi 6.2.1. Mobil fazın (4.10) akış hızı 1.2 ml/dak. ve kolon sıcaklığı 45oC olarak ayarlanır. 6.2.2. Dedektör (5.2) 274 nm’ye ayarlanır. 6.2.3. Mikroşırınga kullanılarak, en az iki kez 20 µl çözelti (6.1.3) kromatografa enjekte edilir ve pik alanları ölçülür. 6.3. Kalibrasyon eğrisi 6.3.1. Her bir standart çözeltiden (4.14) 20 µl enjekte edilir ve pik alanı ölçülür. 6.3.2. Her bir konsantrasyon için alfa-monogliseril 4-aminobenzoata ait pik alanları ile internal standardın pik alanları arasındaki oran hesaplanır. Bu oran ordinatta kütlelerine karşılık gelecek şekilde apsis üzerinde işaretlenir. 6.3.3. Aynı işlemler etil 4-hidroksibenzoat için de yapılır. 7. HESAPLAMA 7.1. 6.3’de elde edilen kalibrasyon eğrisinden, 6.2.3’de hesaplanan pik alanları arasındaki oranlara karşılık gelen kütle oranları (RP1, RP2) okunur. Burada: RP1 = Alfa-monogliseril 4-aminobenzoat kütlesi / etil 4-hidroksibenzoat kütlesi. RP2 = Etil 4-aminobenzoat kütlesi / etil 4-hidroksibenzoat kütlesi. 7.2. Bu yolla hesaplanan kütle oranlarından, aşağıdaki formüle göre alfa-monogliseril 4-aminobenzoat ve etil 4-aminobenzoat içeriği, kütle yüzdeleri (% m/m) olarak hesaplanır. Rp % (m/m) alfa-monogliseril 4-aminobenzoat = RP1 x q 6p Rp % (m/m) etil 4-aminobenzoat = RP2 x q 6p Burada: q = 4.12’de miligram olarak alınan, etil 4-hidroksibenzoat (internal standart) miktarı. p = 6.1.1’de gram olarak alınan örnek miktarı. 8. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO Norm 5725 ) 8.1. % 5’lik (m/m) alfa-monogliseril 4-aminobenzoat içeriği için, aynı örnek üzerinde gerçekleştirilen iki paralel deney sonucu arasındaki fark % 0.25’i geçmemelidir. 8.2. % 1’lik (m/m) etil 4-aminobenzoat içeriği için aynı örnek üzerinde gerçekleştirilen iki paralel deney sonucu arasındaki fark % 0.1’i geçmemelidir. 9. NOTLAR 9.1. Analiz yapılmadan önce, örneğin kromatografi üzerinde internal standart (etil 4-aminobenzoat) piki ile çakışan maddeler içerip içermediği kontrol edilmelidir. 9.2. Herhangi bir çakışmanın olmadığını kontrol etmek için mobil fazdaki metanol oranı % 10 değiştirilerek belirleme tekrarlanır. YÖNTEM II- KLORBUTANOL TAYİNİ 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu yöntem, aeresoller hariç her türlü kozmetik ürünlerdeki % 0.5 (m/m)’lik maksimum konsantrasyona kadar klorbutanol (INN) tayini için uygundur. 2. TANIM Bu metodla numunede tanımlanan klorbutanol miktarı % kütle (% m/m) cinsinden belirlenir. 3. PRENSİP Analiz edilecek ürünün uygun bir şekilde işlemden geçirilmesinden sonra, internal standart olarak 2,2,2-trikloroetanol kullanılarak gaz kromatografi ile tayin yapılır. 4. REAKTİFLER Kullanılan bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. 4.1. Klorbutanol (1,1,1-trikloro-2-metilpropan-2-ol) 4.2. 2,2,2-Trikloroetanol 4.3. Mutlak alkol 4.4. Standart klorbutanol çözeltisi: 100 ml etanol (4.3) içinde 0.025 gr (m/v) 4.5. Standart 2,2,2-trikloroetanol çözeltisi: 100 ml etanol (4.3) içinde 4 mg (m/v) 5. EKİPMAN 5.1. Normal laboratuvar düzenekleri 5.2. Elektron yakalama dedektörlü, N: 63, gaz kromatografi cihazı 6. İŞLEM 6.1. Örneğin hazırlanması Örnek 0,1-0,3 gr arasında tam tartılır. 100 ml.lik bir ölçülü balon içine aktarılır. Etanol (4.3) içinde çözülür. 1 ml internal standart (4.5) ilave edilir ve hacme kadar etanol (4.3) ile tamamlanır. 6.2. Gaz kromatografi şartları 6.2.1. Gaz kromatografi şartları R ³ 1,5 rezolüsyon faktörü vermelidir. R = 2 d’R2 – d’R1 W1 + W2 Burada: R1 ve R2 = Piklerin alıkonma zamanları, dakika olarak. W1 ve W2 = Piklerin yarı yükseklikteki genişlikleri, mm olarak. d’ = Kağıt hızı mm/dak. olarak. 6.2.2. Örnek olarak aşağıdaki operasyon koşulları istenen rezolüsyonu sağlamaktadır. Kolon I II Materyal Cam Paslanmaz Çelik Uzunluk 1.80 m 3 m Çap 3 mm 3 mm Dolgu maddesi % 10 Carbowax 20 M TPA üzerine gaschrom Q 80-100 mesh WAW DMCS 80-100 mesh Üzerine % 5 OV 17 Şartlandırma 190oC sıcaklıkta 2 ila 3 gün Sıcaklık Enjektör 200oC 150oC Sütun 150oC 100oC Dedektör 200oC 150oC Taşıyıcı gaz Azot Argon/metan (95/5, v/v) Akış hızı 35 ml/dakika 35 ml/dakika 6.3. Standart Eğri 5 adet 100 ml.lik ölçülü balon kullanılarak, 1 ml standart çözelti (4.5) ve 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 ve 0.6 ml çözelti (4.4) sırasıyla ilave edilir, hacme etanolle (4.3) tamamlanır ve karıştırılır. 6.2.2’de tarif edilen operasyon şartlarına uygun olarak bu çözeltilerin her birinden 1 µl kromatografa enjekte edilir ve apsis olarak klorbutanol kütlesinin 2,2,2-trikloroetanol kütlesine oranı, ordinat olarak da karşılık gelen pik alanları işaretlenmek suretiyle bir kalibrasyon eğrisi çizilir. 6.4. 6.1.’de elde edilen çözeltiden 1 µl enjekte edilir ve 6.2.2’de tarif edilen şartlara göre işleme sokulur. 7. HESAPLAMA 7.1. Standart eğriden (6.3), çözelti (6.1) içindeki µg klorbutanol olarak “a” ile ifade edilen miktar hesaplanır. 7.2. Örnekteki klorbutanol içeriği aşağıdaki formüle göre hesaplanır: % klorbutanol (m/m)= a x 102 = __a__ p x 106 p x 104 8. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO Norm 5725 ) % 0.5’lik (m/m) klorbutanol içeriği için, aynı örnek üzerinde yapılan iki deney sonucu arasındaki farkı % 0.01’i geçmemelidir. NOT: Sonuç maksimum izin verilen konsantrasyona eşit veya büyük ise, çalışma olup olmadığını kontrol etmek gerekir. YÖNTEM III- KİNİN TANI VE TAYİNİ A. TANIMLAMA 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu yöntem ile şampuan ve saç losyonlarında kinin varlığının tespit edilmesi amaçlanmaktadır. 2. PRENSİP Tanımlama, silikajel üzerinde ince tabaka kromatografisi ile yapılır. 360 nm’de asidik şartlar altında, mavi floresan kininin varlığını gösterir. Doğrulamak için floresan brom buharı ile elimine edilir ve amonyak buharlarıyla sarımsı floresan oluşur. 3. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. 3.1. Floresansız silikajel plaklar, 0.25 mm kalınlık, 200 mm x 200 mm 3.2. Yürütme solvanı: Toluen / dietileter / diklorometan / dietilamin / 20 / 20 / 20 / 8 (v/v/v/v) 3.3. Metanol 3.4. Sülfürik asit (% 96, d20= 1.84) 4 3.5. Dietil eter 3.6. Püskürtme solvanı: Soğutulmuş bir kapta 95 ml dietiletere (3.5) 5 ml sülfürik asit (3.4) dikkatli biçimde ilave edilir. 3.7. Brom 3.8. Amonyum hidroksit çözeltisi, (% 28; d20 = 0.90) 4 3.9. Susuz kinin 3.10. Standart çözelti: Yaklaşık 100 mg susuz kinin (3.9) tam tartılır. 100 ml’lik ölçülü balona alınır, hacme metanol (3.3) ile tamamlanır. 4. EKİPMAN 4.1. İnce tabaka kromatografi için düzenek 4.2. Ultrasonik banyo 4.3. Milipor filtre, FH 0,5 µm veya eşdeğeri ve uygun filtrasyon ekipmanı 5. İŞLEM 5.1. Örneğin hazırlanması Yaklaşık 100 mg kinin içeren örnek tam tartılır, 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır ve hacme kadar metanol (3.3) ile tamamlanır. Ağzı kapatılır ve ultrasonik banyo (4.2) içinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle bırakılır. Daha sonra süzülür (4.3) ve elde edilen filtrat kromatografi için kullanılır. 5.2. İnce tabaka kromatografisi 1 µl standart çözelti (3.10) ve 1 µl örnek çözelti (5.1) silikajel plağa (3.1) damlatılır. Daha önce yürütme solvanı (3.2) ile doyurulmuş tanka konulan plak, 150 mm yürütülür. 5.3. Belirleme 5.3.1. Plak oda sıcaklığında kurutulur. 5.3.2. Püskürtme solvanı (3.6) püskürtülür. 5.3.3. Plak oda sıcaklığında 1 saat süreyle kurutulur. 5.3.4. 360 nm dalga boyuna ayarlı UV lambası ışığı altında izlenir. Kinin floresan yoğun mavi leke olarak ortaya çıkar. Örnek yoluyla, aşağıdaki tablo kinin ile ilgili temel alkoloitlerin 3.2’deki yürütme solvanındaki Rf değerlerini gösterir. Alkoloid Rf Kinin 0.20 Kinidin 0.29 Kinkonin 0.33 Kinkonidin 0.27 Hidrokinidin 0.17 5.3.5. Kinin varlığını doğrulamak için plak yaklaşık bir saat brom buharına (3.7) tutulur. Floresan kaybolur. Aynı plak amonyak buharına (3.8) tutulduğu zaman kahverengi lekeler tekrar belirir ve plak 360 nm UV ışığı altında incelendiğinde sarımtrak floresan görülebilir. Tespit limiti: 0.1 µg kinin B. TAYİN 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu yöntem, şampuanlarda maksimum % 0.5 (m/m), saç losyanlarında maksimum % 0.2 oranında izin verilen kinin tayini için uygulanır. 2. TANIM Bu yöntemle bulunan, örnekteki kinin miktarı % (m/m) kütle cinsinden verilir. 3. PRENSİP Analiz edilecek ürünün uygun biçimde işleme sokulmasından sonra, tayin yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile (HPLC) yapılır. 4. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalı ve HPLC’ye uygun olmalıdır. 4.1. Asetonitril 4.2. Potasyum dihidrojenortofosfat (KH2PO4) 4.3. Ortofosforik asit (% 85; d20= 1.7) 4 4.4. Tetrametilamonyum bromür 4.5. Susuz kinin 4.6. Metanol 4.7. Ortofosforik asit çözeltisi (0.1 M): 11.53 g. Ortofosforik asit (4.3) tartılır. 1000 ml.lik ölçülü balon içinde suda çözülür. Su ile hacme tamamlanır. 4.8. Potasyum dihidrojenortofosfat çözeltisi (0.1 M): 13.6 g potasyum dihidrojenortofosfat (4.2) tartılır. 1000 ml.lik ölçülü balon içinde suda çözülür, su ile hacme tamamlanır. 4.9. Tetrametilamonyum bromür çözeltisi: 15.40 g tetrametil-amonyum bromür (4.4) tartılır. 1000 ml’lik ölçülü balon içinde suda çözülür, su ile hacme tamamlanır. 4.10. Yürütme solvanı: Ortofosforik asid (4.7) / potasyum dihidrojen ortofosfat (4.8) / tetrametilamonyum bromür (4.9) / su / asetonitril (4.1) / 10 / 50 / 100 / 340 / 90 (v/v/v/v/v) Rezolüsyon faktörü R ³ 1.5 elde etmek için mobil fazın oranları değiştirilebilir. R = 2 d’R2 – d’R1 W1 + W2 Burada: R1 ve R2 = Alıkonma zamanı dakika olarak W1 ve W2 = Yarı yükseklikteki pik genişlikleri milimetre olarak d’ = Dakikada mililitre olarak grafik hızı 4.11. Oktadesilsilan ile işlenmiş silika, 10 µm 4.12. Standart çözeltiler: Yaklaşık 5, 10, 15 ve 20 mg susuz kinin (4.5) sırasıyla tam tartılır ve 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır. Hepsi hacme kadar metanol (4.6) ile tamamlanır ve kinin çözülünceye kadar karıştırılır. Her bir örnek 0.5 µm’lik filtreden süzülür. 5. EKİPMAN 5.1. Genel laboratuvar düzenekleri 5.2. Ultrasonik banyo 5.3. Değişken dalga boyu dedektörü olan yüksek basınçlı sıvı kromatografi cihazı 5.4. Kolon: Uzunluk : 250 mm İç çap : 4.6 mm Dolgu materyali : silika (4.11) 5.5. Uygun filtre düzeneği ile birlikte milipor filtre FH 0.5 µm veya eşdeğeri 6. İŞLEM 6.1. Örnek hazırlanması 10 mg susuz kinin içerecek şekilde yeteri kadar ürün miktarı tartılarak 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır. 20 ml metanol (4.6) ilave edilir. 20 dakika süreyle ölçülü balon ultrasonik (5.2) banyoya konulur. Metanolle (4.6) hacme tamamlanır. Çözelti karıştırılır ve süzülür. 6.2. Kromatografi Akış hızı : 1 ml/min Dedektör dalga boyu : (5.3): 332 nm Enjeksiyon hacmi : 10 µl filtre edilmiş çözelti (6.1) Ölçüm : Pik alanı 6.3. Kalibrasyon eğrisi 10 µl kadar her bir referans çözelti (4.12), en az üç defa enjekte edilir. Pik alanları ölçülür ve her bir konsantrasyondaki ortalama alan hesaplanır. Kalibrasyon eğrisi hazırlanır ve doğrusal olduğu doğrulanır. 7. HESAPLAMA 7.1. Kalibrasyon eğrisine (6.3) bakarak enjekte edilen miktara (6.2) karşı gelen susuz kinin miktarı (µg olarak) belirlenir. 7.2. Örnekteki susuz kinin konsantrasyonu, % kütle olarak (m/m) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır. % (m/m) Susuz kinin = B A Burada: B = 10 µl filtre edilen çözelti (6.1) içinde belirlenen susuz kinin (mikrogram olarak) miktarıdır. A = Gram olarak örnek kütlesidir (6.1) 8. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO Norm 5725 ) % 0.5’lik (m/m) susuz kinin miktarı için, aynı örnekte paralel olarak yapılan belirlemeler arasındaki fark % 0.02’yi geçmemelidir. % 0.2’lik (m/m) susuz kinin miktarı için, aynı örnekte paralel olarak yapılan belirlemeler arasındaki fark % 0.01’i geçmemelidir. YÖNTEM IV- İNORGANİK SÜLFİT VE HİDROJEN SÜLFİT TANI VE TAYİNİ KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod kozmetik ürünlerdeki inorganik sülfitlerin ve hidrojen sülfitlerin tanı ve tayini yöntemlerini içermektedir. Metod yanlızca su veya alkol fazına sahip ürünlerdeki max % 0.2 kükürtdioksid konsantrasyonlarında uygulanır. A. TANIM 1. PRENSİP Örnek hidroklorik asit içinde ısıtılır ve serbest kükürtdioksid kokusundan veya indikatör kağıdı üzerindeki etkisinden teşhis edilir. 2. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. 2.1. Hidroklorik asid (4M) 2.2. Potasyum iyodat nişasta kağıdı veya diğer uygun bir alternatif 3. DÜZENEK 3.1. Normal laboratuvar düzenekleri 3.2. Kısa bir geri soğutucu ucuna takılmış balon (25 ml) 4. İŞLEM 4.1. Balon (3.2) içine 10 ml hidroklorik asit (2.1) ile birlikte 2.5 gr civarında örnek konulur. 4.2. Karıştırılır ve kaynayıncaya kadar ısıtılır. 4.3. Kükürtdioksid çıkışı kokusundan yada indikatör kağıdı yardımı ile anlaşılır. B. TAYİN 1. TANIM Bu metodla yapılan tayin sonucu numunedeki sülfit ve hidrojen sülfit miktarı % kütle kükürtdioksid cinsinden verilir. 2. PRENSİP Numunenin asitlendirilmesinden sonra, açığa çıkan kükürt, hidrojen peroksid solüsyonu içine distillenir ve oluşan sülfürik asit standardize edilmiş NaOH’e karşı titre edilir. 3. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. 3.1. Hidrojen peroksit % 0.2 (m/v), günlük hazırlanır. 3.2. Ortofosfarik asit (d 25= 1.75) 4 3.3. Metanol 3.4. Sodyum hidroksit (0.01 M) standart çözelti 3.5. Azot 3.6. İndikatör: Metil kırmızısı (% 0.03 m/v etanol içinde) ve metilen mavisi (% 0.05 m/v etanol içinde) 1 / 1 (v/v). Çözelti filtre edilir. 4. DÜZENEK 4.1. Normal laboratuvar düzenekleri 4.2. Distilasyon düzeneği (Şekle bakınız) 5. İŞLEM 5.1. Yaklaşık 2.5 gr test örneği distilasyon balonuna (A) tam tartılır. (Şekle bakınız) 5.2. 60 ml su, 50 ml metanol (3.3) ilave edilir ve karıştırılır. 5.3. 10 ml hidrojen peroksit (3.1), 60 ml su ve birkaç damla indikatör (3.6) D balonuna (Şekle bakınız) konulur. İndikatör yeşil oluncaya kadar birkaç damla sodyum hidroksit (3.4) damlatılır. 5.4. Aynı işlem (5.3) yıkama şişesi E için tekrarlanır (Şekle bakınız). 5.5. Düzenek kurulur ve azot (3.5) akışı dakikada 60 baloncuk olacak şekilde ayarlanır. 5.6. 15 ml ortofosforik asit (3.2) huni kullanılarak distilasyon balonu A’ya aktarılır. 5.7. Balon kaynayıncaya kadar hızlıca ısıtılır ve daha sonra toplam 30 dakika süreyle hafifçe kaynatılır. 5.8. D balonu ayrılır. Geçiş kısımları çalkalanır ve çözelti yeşil oluncaya kadar (3.6) sodyum hidroksit çözeltisi (3.4) ile titre edilir. 6. HESAPLAMA Örnekteki sülfit veya hidrojen sülfit miktarı aşağıdaki formüle göre % kütle olarak hesaplanır. % m/m kükürtdioksit = 3.2 MV m Burada: M = Sodyum hidroksit çözeltisinin (3.4) molar konsantrasyonu. V = Titrasyon (5.8) için gereken sodyum hidroksit (3.4) hacmi (mililitre olarak). m = Test örneğinin (5.1) gram olarak kütlesi. 7. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO Norm 5725 ) % 0.2 m/m kükürtdioksid içeriği için aynı örnek üzerinde yapılan iki paralel deney sonucu arasındaki fark % 0.006’yı geçmemelidir. Kükürt dioksit distilasyon düzeneği (Tanner’e göre) Tüm boyutlar mm’dir. YÖNTEM V- ALKALİ METAL KLORATLARI TANI VE TAYİNİ KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod diş macunlarındaki ve diğer kozmetik preparatlardaki kloratların tanı ve tayinini tanımlar. A. TANIM 1. PRENSİP Kloratlar ince tabaka kromatografisi ile ayrılır ve iyodürlerin iyoda oksidasyonu ile tanımlanır. 2. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. 2.1. Referans çözeltiler: Taze hazırlanmış potasyum klorat, bromat ve iodat (% 0.2 m/v)’ın sulu çözeltileri. 2.2. Yürütme solvanı: Amonyak solüsyonu (% 23 m/v) / aseton / butanol (60 / 130 / 30, v/v/v) 2.3. Potasyum iyodür sulu çözeltisi (% 5 m/v) 2.4. Nişasta çözeltisi (% 1 - % 5 m/v) 2.5. Hidroklorik asit (1M) 2.6. Kullanıma hazır selüloz ince tabaka plakları (0.25 mm) 3. DÜZENEK İnce tabaka kromatografisi için düzenekler. 4. İŞLEM 4.1. 1 gr test örneği, su ile ekstre edilir, süzülür ve yaklaşık 25 ml’ye kadar seyreltilir. 4.2. 2 µl çözelti (4.1) ile birlikte her üç referans çözeltisinden (2.1) 2 µl plak (2.6) üzerine damlatılır. 4.3. Plak (2.6) tanka konulur. Yürütme solvanı (2.2) içinde plağın dörtte üçü yüksekliğine kadar yürütülür. 4.4. Plak tanktan çıkartılır ve kurumaya bırakılır. (Bu işlem iki saat sürebilir.) 4.5. Plağa potasyum iodür (2.3) püskürtülür ve yaklaşık beş dakika kurumaya bırakılır. 4.6. Plağa nişasta çözeltisi (2.4) püskürtülür ve yaklaşık beş dakika kurumaya bırakılır. 4.7. Plağa hidroklorik asit (2.5) püskürtülür. 5. DEĞERLENDİRME Klorat var ise, yarım saat sonra Rf değeri yaklaşık 0.7 - 0.8 olan mavi bir leke (kahverengi olması da mümkündür) belirir. Helatlar Rf İodat 0 - 0.2 Bromat 0.5 - 0.6 Klorat 0.7 - 0.8 Bromatlar ve iodatların derhal tepkimeye girdiklerine dikkat edilmelidir. Bromat ile klorat kaynaklı lekelerin karıştırılmamasına özen gösterilmelidir. B. TAYİN 1. TANIM Bu metodla tayin edilen klorat miktarı % kütle klorat cinsinden belirtilir. 2. PRENSİP Klorat çinko tozu ile asidik ortamda indirgendikten sonra oluşan klorür AgNO3 solüsyonu kullanılarak potansiyometrik titrasyonla ölçülür. 3. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. 3.1. Asetik asit % 80 (m/m) 3.2. Çinko tozu 3.3. Gümüş nitrat standart solüsyonu (0.1 M) 4. EKİPMAN 4.1. Normal laboratuvar düzeneği 4.2. Gümüş indikatör elektrodlu potansiyometrik titrasyon cihazı 5. İŞLEM 5.1. Örneğin hazırlanması Test örneğinden santrifüj tüpüne yaklaşık 2 gr (m) tam tartılır. Yaklaşık 15 ml asetik asit (3.1) ilave edilir ve dikkatli biçimde karıştırılır. 30 dakika bekletilir ve 15 dakika 2000 devir/dk. ile santrifüjlenir. Üstteki çözelti, 50 ml’lik ölçülü balona aktarılır. Kalıntıya 15 ml asetik asit (3.1) ilave edilerek iki defa santrifüjleme tekrarlanır. Klorat içeren çözelti aynı ölçülü balona alınır ve hacme kadar asetik asit (3.1) ile tamamlanır. 5.2. Kloratın indirgenmesi 20 ml çözelti (5.1) geri soğutucu balonuna alınır. Üzerine 0.6 gr çinko tozu (3.2) ilave edilir. Geri soğutucu altında 30 dakika kaynatıldıktan sonra soğutularak süzülür, balon su ile çalkalanarak süzüntüler birleştirilir. 5.3. Klorür tayini Potansiyometre (4.2) kullanılarak gümüş nitrat (3.3) ile 20 ml çözelti (5.2) titre edilir. 20 ml çözelti (5.1), gümüş nitrat (3.3) ile aynı şekilde titre edilir. NOT: İndirgemeden sonra eğer ürün, bromür veya iyodürleri açığa çıkaracak bromür veya iyodür türevleri içerirse, titrasyon eğrisi birden çok dönüm noktasına sahip olacaktır. Bu durumda, klorüre karşılık gelen titre edilmiş çözelti (3.3) hacmi, sonuncu ve sondan bir önceki dönüm noktalar ı arasındaki fark kadar olur. 6. HESAPLAMA Örnek içindeki klorat miktarı (% m/m) aşağıdaki formül ile hesaplanır. Klorat (CIO-3) % m/m = 20.9 (V – V’) M m Burada: V = Çözelti (5.2)’yi titre etmek için kullanılan gümüş nitrat çözeltisinin (3.3) mililitre olarak hacmi. V’ = 20 ml çözelti (5.1)’yi titre etmek için kullanılan gümüş nitrat çözeltisinin (3.3) mililitre olarak hacmi. M = Gümüş nitrat standart çözeltisi (3.3)’nin molaritesi. m = Örneğin gram olarak kütlesi. 7. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO Norm 5725) % 3 - % 5 m/m klorat içeriği için aynı örnek üzerinde paralel olarak yapılan iki deney sonucu arasındaki fark % 0.07 m/m’i geçmemelidir. YÖNTEM VI- SODYUM IYODAT TANI VE TAYİNİ KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu yöntem kozmetik ürünlerde sodyum iyodat içeriğinin tanı ve tayinini tarif eder. A. TANI 1. PRENSİP Sodyum iyodat ince tabaka kromatografisiyle diğer helat’lardan (klorat, bromat) ayrıldıktan sonra, iyodürün iyoda oksidasyonu üzerinden teşhis edilir. 2. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. 2.1. Referans çözeltiler: Potasyum klorat, bromat ve iodat’ın (% 0.01 m/v) sulu çözeltileri, taze olarak hazırlanır. 2.2. Tank solüsyonu (yürütme solvanı): Amonyak çözeltisi (% 28 m/v) / aseton / butanol (60 / 130 / 30, v/v/v) 2.3. Potasyum iyodür sulu çözeltisi (% 5 m/v) 2.4. Nişasta çözeltisi (% 1 - 5 m/v) 2.5. Hidroklorik asit (1 M) 3. DÜZENEK 3.1. Kullanıma hazır selüloz ince tabaka (0.25 mm) plakları 3.2. İnce tabaka kromatografi düzenekleri 4. İŞLEM 4.1. Yaklaşık 1 gr örnek, su ile ekstre edilir, süzülür ve yaklaşık 10 ml’ye su ile seyreltilir. 4.2. Bu çözeltinin 2 µl’si plağın (3.1) taban çizgisi üzerine damlatılır ve her bir referans çözeltisinden de (2.1) 2 µl damlatılır. 4.3. Plak tanka konulur, yürütme solvanı (2.2) ile plağın yaklaşık dörtte üçünü kaplayacak şekilde yürütülür. 4.4. Plak tanktan alınır ve oda sıcaklığında kurumaya bırakılır. (Bu iki saat sürebilir.) 4.5. Plağa potasyum iyodür (2.3) püskürtülür ve beş dakika kurumaya bırakılır. 4.6. Plağa nişasta (2.4) püskürtülür ve yaklaşık beş dakika kurumaya bırakılır. 4.7. Son olarak hidroklorik asit (2.5) püskürtülür. 5. DEĞERLENDİRME İyodat mevcut ise, hemen Rf değeri yaklaşık 0 - 0.2 olan mavi bir leke (renk kahverengi olabilir veya bekletme sırasında kahverengine dönüşebilir.) belirir. Bromatların yaklaşık 0.5 - 0.6 olan Rf değerlerinde ve kloratların yaklaşık 30 dakika sonra 0.7 - 0.8 olan Rf değerlerinde derhal tepkimeye girdiklerine dikkat edilmelidir. B. TAYİN 1. TANIM Bu metodla tayin edilen sodyum iyodat miktarı % kütle cinsinden belirtilir. 2. PRENSİP Sodyum iyodat suda çözülür ve reverse-phase C18 ve anyon değiştirici kolonlar seri bağlanmış halde kullanılarak yüksek performanslı likit kromatografisi yöntemiyle tayin edilir. 3. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalı ve özellikle yüksek basınçlı likit kromatografisine (HPLC) uygun olmalıdır. 3.1. Hidroklorik asit (4M) 3.2. Sodyum sülfit (sulu) % 5 m/v 3.3. Sodyum iyodat stok solüsyonu: 50 mg sodyum iyodat 100 ml suda çözülür. 3.4. Potasyum dihidrojenortofosfat 3.5. Disodyum hidrojenortofosfat. 2H2O 3.6. HPLC mobil faz: 1 litre su içinde, 3.88 gr potasyum dihidrojenortofosfat (3.4) ve 1.19 gr disodyum hidrojenortofosfat. 2H2O (3.5) çözülür. 3.7. Universal indikatör kağıdı, pH 1-11 4. EKİPMAN 4.1. Genel laboratuvar düzenekleri 4.2. Yuvarlak filtre kağıdı: çap 110 mm, Schleicher ve Schüll no 575 veya eşdeğeri 4.3. Değişken dalga boylu dedektörü olan yüksek basınçlı sıvı kromatografi 4.4. Kolon: Uzunluk : 120 mm İç çap : 4.6 mm Birbirine seri bağlı : Birinci kolon - NecleosilR 5C18 veya eşdeğeri, İkinci kolon – VydacTM - 301 - SB veya eşdeğeri 5. İŞLEM 5.1. Örneğin hazırlanması 5.1.1. Sıvı örnekler (şampuanlar) 10 ml.lik ölçülü balona yaklaşık 1 gr test örneğinden tam tartılır. Su ile tamamlanır, karıştırılır. Gerekirse süzülür. Bölüm 5.2’de açıklanan HPLC yöntemiyle çözeltideki iyodat tayin edilir. 5.1.2. Katı örnekler (sabun) Örnek uygun biçimde kısımlara ayrılır ve 100 ml cam kapaklı ölçülü balon içine yaklaşık 1 gr örnek tam tartılır. 50 ml su ilave edilir ve bir dakika hızlı biçimde çalkalanır. Santrifüjlenir ve filtre kağıdı (4.1) kullanılarak süzülür veya karışım en az bir gece beklemeye bırakılır. Jelatin benzeri çözelti, hızlı biçimde çalkalanır ve filtre kağıdı (4.1) kullanılarak süzülür. Bölüm 5.2’de açıklanan HPLC yoluyla çözeltideki filtre edilen iyodat tayin edilir. 5.2. Kromatografi Akış hızı : 1 ml/dak. Dedektör dalga boyu (4.2) : 210 nm Enjektör hacmi : 10 µl Ölçüm : Pik alanı 5.3. Kalibrasyon Sırasıyla 1, 2, 5, 10 ve 20 ml sodyum iyodat stok çözeltisi (3.3) 50 ml.lik ölçülü balona pipetlenir, hacme tamamlanır ve karıştırılır. Bu şekilde elde edilen çözelti, 1 ml için 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 ve 0.20 mg sodyum iyodat içerir. Her bir standart iyot çözeltisinden 10 µl’lik kısmı, sıvı kromatografa (4.2) enjekte edilir ve bir kromatogram elde edilir. İyodat için pik alanları belirlenir ve sodyum iyodat konsantrasyonuna ilişkin pik alanlarına ait eğri çizilir. 6. HESAPLAMA Aşağıdaki formül kullanılarak sodyum iyodat içeriği % kütle olarak (% m/m) hesaplanır. % (m/m) sodyum iyodat = Vc 10 m Burada: m = Test örneğinin (5.1) gram olarak kütlesi. V = 5.1’de açıklandığı gibi elde edilen örnek çözeltinin ml olarak toplam hacmi. c = Kalibrasyon eğrisi (5.3)’nden elde edilen sodyum iodat konsantresidir (1 ml sodyum iyodat başına mg olarak). 7. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO Norm 5725) % 0.1’lik (m/m) sodyum iyodat içeriği için, aynı örnek üzerinde paralel olarak yapılan iki deney sonucu arasındaki fark % 0.002’yi geçmemelidir. 8. DOĞRULAMA 8.1. Prensip Kozmetik bir ürünün asitlendirilmiş solüsyonunda iyodat (IO-3) sülfit vasıtasıyla iyoda (I-) indirgenir. Elde edilen solüsyon HPLC kullanılarak araştırılır. Eğer sülfitle muamele edildikten sonra iyodad piki kaybolursa ana pik büyük bir olasılıkla iyodata aittir. 8.2. İşlem Bölüm (5.1)’de açıklandığı gibi elde edilen örnek çözeltinin 5 ml.lik kısmı pipet ile bir erlene alınır. Evrensel indikatör kağıdı (3.7) ile çözeltinin pH değeri 3’e ayarlanır veya hidroklorik asit (3.1) ile düşürülür. Üç damla sodyum sülfit çözeltisi (3.2) ilave edilir ve karıştırılır. Çözeltinin 10 µl’si sıvı kromatograma (4.2) enjekte edilir. Bu kromatogram ile aynı örnek için, 5. paragrafta açıklandığı şekilde elde edilen kromatogram karşılaştırılır.